正在微生物工程帮力杂萜自然产品高效合成范畴赢得紧张冲破。该团队通过编造的代谢工程和酶工程战略，得胜冲破了闭头手性砌块的界限化造备瓶颈，将drimane型手性砌块的微生物发酵产量擢升至克级秤谌。基于获取的手性砌块，团队进一步实行了多个拥有生物活性的杂萜自然产品的高效精练合成。该筹议功劳以Microbe Engineering to Provide Drimane-Type Building Blocks for Chiral Pool Synthesis of Meroterpenoids为题楬橥正在国际着名期刊Angewandte Chemie International Edition上（）。

　　杂萜自然产品是一类机闭多样、生物活性广博的庞大自然产品，目前已出现突出500个化合物（图1A）。个中，pyripyropene C对酰基辅酶A：胆固醇酰基变动酶（ACAT）显示出强效的逼迫活性（IC50为53 nM），zonarol (1)拥有神经袒护功用，ent-(+)-chromazonarol (2)是一个针对农作物病原菌的潜正在防治药物，mycoleptodiscin A (3)显示出中等的抗菌活性，而pelorol (4)对真菌显示出优异的逼迫活性（EC50为7.7 μM）。这些化合物均以drimane骨架（蓝色标注个人）与非萜类个人变成特有的杂合机闭，正在药物开垦和农业行使方面呈现出优秀的开垦潜力，然而其高效合成连续是一个紧张挑拨。

　　古板的杂萜自然产品合成战略要紧依赖两种本事（图1B）：立体挑选性多环化和手性合成子法。立体挑选性多环化本事往往举措冗长，且正在闭头的生物模仿环化举措中立体挑选性难以掌管。而手性合成子法固然立体化学清楚，但要紧依赖植物由来的香紫苏内酯或香紫苏醇动作开始原料，须要3-6步的侧链降解响应才华获取倾向C15中央体，这不但低浸了原子经济性，也影响了全部合成出力。

　　近年来，筹议出现drimenol (5)和albicanol (6)这类drimane型化合物可能动作替换性手性砌块，它们也许与芳基卤代物直接偶联，无需碳链降解进程，为杂萜自然产品供应了更为精练的合成途径。然而，这些C15化合物正在天然界中含量极其有限，且以往报道的异源临盆本事产量广大较低，比如正在烟草叶片中表达PhDS基因获取的drimenol产量仅为392 μg/g鲜重，而正在酵母中临盆albicanol须要4L培育基和96幼时发酵才华获取8.3 m物。这种低效的临盆形式重要限度其动作手性砌块的进一步开垦。

　　面临这一闭头瓶颈题目，筹议团队开垦了归纳的微生物工程战略（图1C）。该战略起初操纵“人为两步法”PhoN-IPK编造来供应萜类前体，这一编造可能将表源增加的五碳醇DMAA/ISO直接转化为五碳焦磷酸前体IPP和DMAPP，明显简化了古板MVA或MEP途径（图1C）。正在此底子上，团队通过两个闭头战略来擢升倾向产品的产量：战略1引入生物合成通道中Nudix水解酶从而进步产品滴度；战略2则通过对PhoN-IPK编造中闭头磷酸化酶PhoN举行理性打算和改造从而进步底物转化出力。

　　正在初始阶段，筹议团队起初对drimenol合酶举行筛选（图2A）。通过比拟SsDMS、ScDMS和CavC三个由来差其余drimenol合酶，出现它们的产量不同并不明显（13-15 mg/L）。因为II型萜类环化酶发作的中央产品带有焦磷酸基团，筹议职员推测大肠杆菌内源水解酶的低出力也许是限度产量的闭头成分。进一步对drimenol生物合成基因簇解析出现，SsDMS上游存正在Nudix水解酶（SsNDH）。经测验证据，引入SsNDH后产量明显擢升至63 mg/L。

　　图2. Drimenol临盆的优化战略. (A) 三种差别由来的细菌drimenol合酶产量对照; (B) SsNDH-SsDMS协调卵白构修示妄图。单酶、分别酶单位和拥有差别长度linker的协调卵白(n=0-4)，插图显示了毗邻linker的构成; (C) 差别酶陈列形式和协调构修体(n=0-4)对drimenol产量的优化; (D) 优化后的SsNDH-SsDMS协调卵白的机闭预测模子，个中SsNDH（粉色）通过柔性linker（蓝色）与SsDMS（橙色，显示β和γ亚基）相连。

　　为了进一步优化催化出力，团队打算了差其余酶表达形式（图2B）。思索到空间左近性也许有帮于底物传达，筹议职员构修了SsNDH-SsDMS协调卵白。通过AlphaFold2预测的机闭显示，两个酶的活性位点可能通过柔性linker毗邻实行优秀的空间结构。正在对linker长度举行优化后（图2C），产量进一步擢升至111 mg/L。预测的协调卵白机闭（图2D）明显地映现了SsNDH（粉色）和SsDMS（橙色）通过柔性linker（蓝色）变成的空间排布。

　　图3. PhoN的工程化改造. (A) 含活性位点口袋的PhoN同源模子。插图：与DMAP相距4Å内的闭头残基; (B) 图A落选定残基的丙氨酸扫描结果; (C) 电荷改观突变的静电表面化装，野生型vs突变体; (D) 带电突变对产量的影响; (E) 按进化落伍性着色的PhoN表面映现图; (F) PhoN同源序列的序列标识，方框内标出突变靶点; (G) 基于落伍性向导的突变对产量的影响。

　　即使通过协调卵白战略明显擢升了产量，但111 mg/L的产量仍难以知足实质行使需求。团队细心到正在统统响应进程中，PhoN催化的可逆磷酸化和水解响应也许是另一个闭头的限速举措。通过机闭解析（图3A）出现，PhoN的活性位点由K133、R140、S166、G167、H168、R201、H207和D211等残基构成。对这些位点举行丙氨酸扫描出现突变后产品险些完整耗损（图3B），证据了这些位点的紧张性。

　　基于PhoN催化可逆磷酸化响应的特性，筹议团队提出了一个进步催化出力的新思绪：通过正在活性口袋邻近引入正电荷，加强酶与磷酸基团的彼此功用。通过对DMAP和PhoN的分子对接测验，团队挑选了位于配体4Å领域内的E122、G125、L158和I171举行定点突变。机闭预测显示（图3C），正在差别位点引入精氨酸或赖氨酸会发作差其余结果：E122R/K突变正在底物进入的闭头处所明显添加了正电荷，而G125R/K突变固然添加了电荷但也许会阻滞活性口袋，L158和I171动作内部残基，带电突变对口袋表面电荷的影响较幼。随后的测验结果完整适应这一预测：E122R突变使产量擢升至178 mg/L（进步1.6倍），而G125R/K变体产量重要降落（分歧为17和9 mg/L），L158和I171位点的突变也导致产量明显低浸（均低于10 mg/L）。这种将机闭预测与测验验证相维系的编造本事，分明地表了然正在活性口袋邻近政策性地引入正电荷可能明显进步磷酸化出力。

　　为了进一步优化PhoN的催化出力，团队转向了共进化解析战略。通过解析500个与PhoN序列宛如度突出80%的酸性磷酸酶序列，操纵EMBL-MUSCLE举行多序列比对和ConSurf WEB SERVER举行落伍性解析，将氨基酸残基按落伍水准分为九个等第（图3E）。正在间隔活性口袋12Å领域内，团队识别出六个非落伍残基：S90、Y135、K153、T157、R160和I222（图3E-F）。这些残基正在进化进程中显示出较高的可变性，示意它们也许是潜正在的优化靶点。通过将这些非落伍残基更换为更具落伍性的氨基酸，团队打算了十个PhoN变体。发酵测验显示，S90G、T157K和R160K突变使drimenol产量较野生型进步了约1.2倍。这一结果证据，正在漫长的进化进程中，这个酶家族确实方向于进化出更安靖和更高效的式子。

　　更为可喜的是，当将带电突变（E122R）与进化解析获取的有益突变（T157K和R160K）组当令，发作了明显的协同效应。最优的三突变体E122R/T157K/R160K使drimenol产量到达了398 mg/L，较初始产量擢升了27倍。为分析释这种明显擢升的分子机造，团队得胜解析了PhoNE122R/T157K/R160K的晶体机闭（PDB: 8YC1，图4B-C）。与野生型PhoN比拟，三突变体的等电点从6.08升至7.72，证据表面正电荷明显添加。更紧张的是，分子动力学模仿（图4D）揭示突变体也许与配体支柱长达40 ns的安靖彼此功用，比拟于野生型PhoN安靖功用年华延伸了近20 ns，这也许是其催化出力擢升的闭头来历。

　　正在赢得drimenol临盆的紧张冲破后，筹议团队滥觞评估其正在合成中的行使。然而，正在开头测试drimenol碘代物与芳基碘代物的镍催化还原偶联反适时，因为β-H肃清响应的产生，要紧获得二烯产品。这一结果促使团队转向寻觅albicanol，其碘代物正在Weix要求下也许与差其余芳基卤代物就手产生偶联。基于这一设念，筹议团队将优化后的PhoN-IPK编造行使于albicanol的临盆。通过将SsDMS更换为来自Antrodia cinnamomea的环化酶AncC，初始产量即到达281 mg/L。

　　为了进一步进步albicanol的产量，筹议团队对发酵要求举行了编造优化。通过调控IPTG浓度（0.05 mM）、甘油浓度（2%），以及优化ISO的增加战略，正在摇瓶秤谌将albicanol产量擢升至1805 mg/L。更为紧张的是，正在5L发酵罐中采用两阶段补料战略，即正在OD600到达30时滥觞补料，当albicanol到达1.6 g/L时追加8 g ISO，最终使产量擢升至3.5 g/L（图4E），缔造了微生物发酵临盆albicanol的最高秤谌。

　　合伙复旦大学李付琸课题组针对杂萜类自然产品精练高效合成题目，更始性地将微生物工程与化学合成相维系，设置了一套完全的交叉学科本事体例。筹议团队通过编造的酶工程改造和机闭生物学筹议，得胜冲破了手性砌块界限化造备的瓶颈，并正在分子秤谌阐了然“人为两步法”体例中酸性磷酸酶的催化机造。这一出现不但为后续开垦更高效的drimane型手性砌块生物合成体例供应了表面底子，也为处理其他萜类化合物的临盆困难供应了新思绪。更紧张的是，该筹议为自然产品全合成范畴供应新鲜的筹议范式：通过微生物工程获取闭头手性砌块，继而通过轻巧的化学转化实行倾向分子的高效精练合成。这种战略避免了古板全生物合成中须要拼装庞大酶促级联响应的艰苦，同时也治服了有机全合成中手性源获取艰苦和举措冗长的题目，将明显加快杂萜类生物活性分子的出现和药物开垦经过。